دوماهنامه علمی پژوهشی

مقدمه
پسته (Pistacia vera L.) متعلق به خانواده Anacardiaceeae بوده که بومی آسیای صغیر و آسیای غربی است(1). محصول پسته به‌عنوان یک محصول صادراتی اهمیت خاصی در تولیدات کشاورزی در بعضی کشورها به‌ویژه‌ ایران دارد(2). طبیعتاً ایران در رتبه نخست تولید پسته جهانی است اما به دلیل بالا بودن میزان آفلاتوکسین در پسته، این محصول موقعیت خوبی از نظر بازاریابی جهانی ندارد و این باعث چالش در صادرات پسته ایران شده است(2). پسته‌ در بین محصولات کشاورزی با بالاترین خطر به آلودگی آفلاتوکسین می باشد(3). میوه پسته و محصولات حاوی پسته به منظور ارزیابی کیفیت میکروبی مانند آلودگی قارچی و سطوح آفلاتوکسین مورد آزمایش قرار می‌گیرند(4).
 مایکوتوکسین ها متابولیت های ثانویه قارچ هستند که تأثیرات مخربی بر روی انسان و حیوانات دارند که منجر به بیماری‌ها و زیان‌های اقتصادی می‌شود. آلودگی مواد غذایی و تغذیه با مایکوتوکسین ها در سراسر جهان یک مشکل مهم است(5). آسپرژیلوس فلاووس یک پاتوژن ضعیف گیاهی است که به‌ندرت در مغز پسته سالم دیده می‌شود. مطالعات نشان داده‌اند که زود خندانی پسته‌ها می‌تواند مغز پسته را با اسپور قارچ های تولید کننده آفلاتوکسین با سطح بالای آلودگی آفلاتوکسین، مواجه کند(5،6). آفلاتوکسین ها از مهمترین مایکوتوکسین ها هستند که عمدتاً توسط دو گونه قارچی آسپرژیلوس فلاووس و آسپرژیلوس پارازیتیکوس تولید می‌شود. چهار نوع اصلی آن‌ها AFB₁،AFB₂ ، AFG₁ و AFG₂ می‌باشند(10-6، 3). مطالعات متعدد نشان داده که آفلاتوکسین ها می‌توانند در مزرعه، طی فرآیند و یا انبارداری تولید شوند(11). آفلاتوکسین سمی سرطان‌زا، جهش‌زا و تضعیف‌کننده سیستم ایمنی بدن              می باشد(2).
حضور گونه‌های آسپرژیلوس در پسته باید به‌طورجدی برای تولید آفلاتوکسین پایش شود. فاکتورهایی از قبیل خندانی و رطوبت 88-78 درصد برای جوانه‌زنی آسپرژیلوس فلاووس و تولید آفلاتوکسین موردنیاز است(10).
 قارچ آسپرژیلوس فلاووس همواره به‌عنوان متداول‌ترین قارچ آلوده‌کننده مواد غذایی در منابع علمی ذکرشده است. این‌گونه تمایل ویژه‌ای برای آلودگی دانه‌های آجیلی و روغنی و غلات از خود نشان می‌دهد. این محصولات با دارا بودن چربی و کربوهیدرات بالا از مستعدترین محصولات برای آلودگی و به‌عنوان مناسب‌ترین بستر طبیعی برای رشد قارچ‌های آفلاتوکسین زا در جهان است(12). آلودگی آفلاتوکسین پسته‌ها، بدون شک یک مشکل برای ایران و سایر کشورهای تولیدکننده پسته است(2). تقاضای همیشگی مصرف‌کنندگان، ایمنی و سلامت ماده غذایی است. از جمله راههای پیشگیری از تولید آفلا توکسین مهار رشد قارچ می باشد پرتودهی مواد غذایی یک روش فیزیکی فرآیند مواد غذایی است. این فرآیند،گاهی پاستوریزاسیون سرد نامیده می‌شود(13). پرتودهی مواد غذایی فرآیندی است که غذا با انرژی پرتوهای یونیزان مواجهه می‌یابد(13). پرتودهی با دوزهای متوسط(10-1 کیلوگری) برای حذف آلودگی میکروبی و افزایش ماندگاری مواد غذایی از قبیل میوه و سبزیجات، غذاهای دریایی، ماکیان، ادویه جات و غیره کاربرد دارد(14). از آنجا که مهمترین چالش صادرات پسته ایران، بالا بودن غلظت سم آفلاتوکسین است لذا با توجه به کارایی پرتوالکترونی در کنترل کیفیت بهداشتی مواد غذایی و افزایش عمرماندگاری آنها و نیز نداشتن مواد رادیواکتیویته، بر آن شدیم کاربرد این انرژی در دسترس را برای رفع این چالش مورد مطالعه قرار دهیم. هدف از این تحقیق بررسی اثر پرتوالکترونی بر میزان تولید آفلاتوکسین B₁ توسط آسپرژیلوس فلاووس بوده است.
روش بررسی
به منظور آماده سازی نمونه ها، تعداد 10 بسته200 گرمی از پسته آماده و درزبندی گردید، سپس توسط پرتو الکترونی با دوز 25 کیلوگری در مجتمع پژوهشی ایران مرکزی استریل گردیدند.
جهت آماده سازی سوسپانسیون قارچی سویه آسپرژیلوس فلاووس تولیدکننده آفلاتوکسینB₁ بر روی محیط کشت پوتیتو دکستروز آگار(liofilchem CAT#610102) به مدت 10 روز در 27 درجه سانتی‌گراد کشت داده شد تا تولید اسپور کند. برای تهیه سوسپانسیون قارچ، چند قطره تویین بر روی کلنی های آسپرژیلوس ریخته و پس از چند دقیقه 2-1 لوپ از اسپورها برداشته، در سرم فیزیولوژی حل نموده و تعداد اسپورها در سوسپانسیون مورد آزمایش پس از رقیق شدن با استفاده از لام هموسیتومتر، شمارش گردیده و به غلظت 10⁶ اسپور در هر میلی لیتر رسانده شد. به نمونه‌های 200 گرمی استریل شده میزان 10⁶ اسپور قارچ آسپرژیلوس فلاووس به‌ صورت سوسپانسیون آماده‌شده (6 میلی‌لیتر به ازاء هر 200 گرم نمونه) تلقیح گردید. بعد از تلقیح سوسپانسیون قارچی، به منظور توزیع یکنواخت اسپورها، نمونه ها به صورت دستی هم زده شدند.
سپس نمونه‌ها به موسسه پژوهشی ایران مرکزی جهت اشعه دهی انتقال یافتند. در مرکز پرتودهی نمونه‌های گروه تیمار توسط شتاب‌دهنده الکترون رودوترون TT200، 10MeV تحت دوزهای 1، 3، 5 و 7 کیلوگری در دمای محیط (25 درجه سانتی‌گراد) پرتودهی شدند. نمونه‌های شاهد هم بدون مواجهه با پرتو الکترونی در دمای محیط نگهداری گردیدند.
غلظت آفلاتوکسین B₁ تولیدشده در نمونه‌ها قبل از استریل کردن با دوز 25 کیلوگری و همچنین بعد از تلقیح کپک و             بعد از پرتودهی در دوزهای مختلف در روزهای صفر،210،180،90،60،30 مورد اندازه گیری قرار گرفت.
نمونه‌های پسته پس از پوست گیری به‌صورت پودر درآمده و 20 گرم از نمونه ها با 60 میلی‌لیتر متانول 80 درصد، با یک مخلوط کن با سرعت بالا (120 دور در دقیقه) به مدت 20 دقیقه مخلوط شدند.
 به عصاره به‌دست‌آمده اجازه داده شد تا در حالت سکون به‌صورت دو فاز تبدیل شود و سپس از طریق کاغذ فیلتر (Whatman No.1) فاز روغنی رویی استخراج گردید. عصاره با بافر رقیق‌کننده تا 4 برابر رقیق و با استفاده از کیت الایزا آفلاتوکسین  B₁(Europroxima CAT# 5121AFB ) و با توجه به پروتکل موجود در کیت و توسط دستگاه الایزا خوان(AWARENESS Technology) غلظت آفلاتوکسین اندازه‌گیری گردید.مقادیر بر حسب نانوگرم گزارش شده است. آزمون برای هر نمونه با دو بار تکرار انجام شد.
ترسیم نمودارها توسط نرم افزار Excel نسخه 2010 انجام شد              و مقایسه غلظت سم در نمونه های تیمار  و   شاهد   در   دوزها و
روزهای مختلف با استفاده از نرم افزار SPSS نسخه 16در سطح معنی داری(05/0>P) توسط آزمون Kruskal Wallis بررسی شد.
یافته ها
نتایج نشان داد که نمونه های اولیه پسته بدون آلودگی آفلاتوکسین بودند و بیشترین میزان تولید آفلاتوکسین B₁ در نمونه شاهد روز 60 با 85/164 نانوگرم بر گرم و کمترین میزان سم تولید شده مربوط به دوز 7 کیلوگری گروه های تیمار در روزهای 60 و 180 بود که هیچ سمی شناسایی نشد.
مقادیر آفلاتوکسین B₁ در دوزهای مختلف در روزهای صفر،90،60،30 تغییر معنی داری نیافتند. ولی در روزهای 180 و 210 دارای سطح نزدیک به معنی داری بینابینی گردید(06/=p). همچنین نمونه های کنترل(55/0=p) و نمونه های تیمار شده با دوز 7 کیلوگری(09/=p) در روزهای مختلف دارای سطح نزدیک به معنی داری بودند و در دوزهای 1، 3 و 5 تغییر معنی داری نیافتند(05/0<p).
مقادیر سم تولید شده در سه گروه نمونه ی اولیه پسته، پسته های تلقیح شده و پرتودیده و پسته های کنترل( تلقیح شده و بدون پرتودهی)در نمودارهای 1 و 2 آورده شده است. میانگین درصد کاهش مقادیر آفلاتوکسین در نمونه های تیمار در روزهای مختلف نگهداری در دوزهای 1، 3، 5 و 7 کیلوگری به ترتیب 84/38، 79/48، 50/53، 17/77 درصد بود.

 
 
 
نمودار 1: تغییرات غلطت آفلاتوکسین B₁ به تفکیک دوزهای تیمار و روزهای نگهداری
 







 
نمودار 2:غلظت آفلاتوکسین در دوزهای مختلف در دوره انبارداری

بحث و نتیجه گیری
در مطالعه حاضر اثر پرتو الکترونی بر روند تولید آفلاتوکسین B₁ در دوزهای مختلف و انبارداری پسته در روزهای مختلف مورد بررسی قرار گرفت. نتایج حاصل از اندازه گیری غلظت آفلاتوکسین نشان داد، کاهش مقادیر سم در دوزهای مختلف در دوره نگهداری  بر اثر پرتودهی، می تواند تا حداقل هفت ماه رشد قارچ و متعاقبا تولید سم را به تاخیر بیندازد. لذا میزان آفلاتوکسین تولیدی نزدیک به صفر می باشد. که در مقایسه با گروه کنترل این میزان بسیار کمتر می باشد.
تخریب آفلاتوکسین ها توسط پرتوهای الکترونی و گاما در بعضی مطالعات بررسی شده است. مطالعه ای توسطSupriya  (2014) تحت عنوان آلودگی زدایی قارچی و تقویت ماندگاری لپه لوبیا توسط پرتوالکترونی انجام شد. دانه های تابش نشده لوبیا خشک و لوبیاهای تحت تابش با دوز پرتو الکترونی 5/2، 5، 10 و 15 کیلوگری، در طول 0، 3 و 6 ماه، در شرایط آزمایشگاهی ذخیره شده و تحت نظر قرار گرفتند. کاهش وقوع و بروز گونه های قارچ در نمونه ها وابسته به دوز بودند. اگر چه آفلاتوکسین (B₁ و B₂) در دانه های کنترل و تحت تابش 5/2 و 5 کیلوگری، زیر سطح قابل تشخیص(2> نانوگرم بر گرم) بود ولی در دوزهای 10 و 15 کیلوگری هیچ سمی شناسایی نشد(15). مطالعه ای توسط  Bhat(2014) در دانه های نیلوفرآبی نشان داد که دوز لازم برای آلودگی زدایی کامل قارچ های آسپرژیلوس و آفلاتوکسین 15-10 کیلوگری بود. تخریب یا کاهش آفلاتوکسین در دوز 10 کیلوگری رخ داد(13). در مطالعه ای دیگر در آرد بادام، در نمونه های اولیه مقادیر کمی آفلاتوکسین(5/0 میکروگرم بر گرم) پیدا شد. در این نمونه ها پس از مواجهه با دوز  5/1 کیلوگری پرتوالکترونی، هیچ آفلاتوکسینی شناسایی نشد(16).
همچنین  Rogovschi(2007) اثرپرتوالکترونی بر کاهش آفلاتوکسین های B₁ و B₂ در محیط کشت کوکنات آگار بر آسپرژیلوس فلاووس بعد از 7 روز کشت، پس از پرتودهی با دوز 5 کیلوگری کاهش 5/75درصدی آفلاتوکسین را نشان داد. در حالی که در دوز 50 کیلوگری هیچ آفلاتوکسینی شناسایی نشد(17).
 تفاوت بین نتایج مطالعات ممکن است به شرایط دخیل در پرتودهی مرتبط باشد. رطوبت و فعالیت آب ماده غذایی از جمله فاکتورهایی است که نقش عمده در فرآیند پرتودهی با پرتوهای یونیزان برای قارچ ها دارند. به طور کلی میزان رشد قارچ تولید کننده سم و تولید آفلاتوکسین به شرایط غالب فیزیکی، بیولوژیکی، زیست محیطی و بیوشیمایی بستگی دارد(18).
مطالعات نشان داده که تفاوت در میزان سم تولید شده ممکن است به شرایط بیوشیمایی محصول غذایی بستگی داشته باشد. همچنین منبع کربوهیدرات قابل دسترس آسپرژیلوس فلاووس در تولید آفلاتوکسین موثر است(18).قرار دادن نمونه های پسته در معرض پرتوالکترونی قبل از تولید آفلاتوکسین می تواند با از بین بردن قارچ مولد سم از تولید سم آفلاتوکسین پیشگیری نماید.
تقدیر و تشکر
بدین وسیله از همکاری مجتمع پژوهشی ایران مرکزی، مرکز تحقیقات مولکولی تولید مثل دانشگاه علوم پزشکی و خدمات بهداشتی درمانی یزد و تمام افرادی که در انجام این مطالعه ما را یاری نمودند، تشکر و قدردانی می گردد.
 
تضاد منافع
نویسندگان این مقاله اعلام می دارند که هیچ گونه تضاد منافغی وجود ندارد.

 
References
1-Hepsag F, Golge O, Kabak B. Quantitation of aflatoxins in pistachios and groundnuts using HPLC-FLD method. Food Control 2014;38:75-81.
2-Saremi H, Okhovat M. Effect of aflatoxin produced by Aspergillus flavus in reduction of our pistachio marketing all over the world 2008;2(3):13-19.
3-Dini A, Khazaeli P, Roohbakhsh A, Madadlou A, Pourenamdari M, Setoodeh L, et al. Aflatoxin contamination level in Iran's pistachio nut during years 2009–2011. Food Control 2013;30(2):540-4.
4-Al-Moghazy M, Boveri S, Pulvirenti A. Microbiological safety in pistachios and pistachio containing products. Food Control 2014;36(1):88-93.
5-Zain ME. Impact of mycotoxins on humans and animals. Journal of Saudi Chemical Society 2011;15(2):129-44.
6-Mahoney NE, Rodriguez SB. Aflatoxin variability in pistachios. Applied and environmental microbiology 1996;62(4):1197-202.
7-Klich MA. Environmental and developmental factors influencing aflatoxin production by Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus. Mycoscience 2007;48(2):71-80.
8-Zaini F, Yousefi S, Dadgar S, Safara M. Aflatoxin production by Aspergillus flavus isolates from green–tiger shrimps (Penaeus semisulcatus). Iranian Journal of Microbiology 2009;1(4):18-22.
9-Karami-Osboo R, Mirabolfathy M, Kamran R, Shetab-Boushehri M, Sarkari S. Aflatoxin B1 in maize harvested over 3 years in Iran. Food Control 2012;23(1):271-4.
10-Rahimi P, Sharifnabi B, Bahar M. Detection of aflatoxin in Aspergillus species isolated from pistachio in Iran. Journal of phytopathology 2008;156(1):15-20.
11-Georgiadou M, Dimou A, Yanniotis S. Aflatoxin contamination in pistachio nuts: A farm to storage study. Food control 2012;26(2):580-6.
12-Mohamadi moghadam M, Sobhanipour A, Hokmabadi A. The relationship between the growth of aflatoxin-causing fungus Aspergillus flavus and aflatoxin B₁ production of nutrients and protein in the brain with different varieties of pistachio. Journal of Horticultural Science 2011;1389(2(.
13-Bhat R, Sridhar K, Karim A. Microbial quality evaluation and effective decontamination of nutraceutically valued lotus seeds by electron beams and gamma irradiation. Radiation Physics and Chemistry 2010;79(9):976-81.
14.Lung H-M, Cheng Y-C, Chang Y-H, Huang H-W, Yang BB, Wang C-Y. Microbial decontamination of food by electron beam irradiation. Trends in Food Science & Technology 2015;44:66-78.
15.Supriya P, Sridhar K, Ganesh S. Fungal decontamination and enhancement of shelf life of edible split beans of wild legume Canavalia maritima by the electron beam irradiation. Radiation Physics and Chemistry 2014;96:5-11.
16-Lanza C, Mazzaglia A, Paladino R, Auditore L, Barnà R, Loria D, et al. Characterization of peeled and unpeeled almond (Prunus amygdalus) flour after electron beam processing. Radiation Physics and Chemistry 2013;86:140-144.
17-Rogovschi VD, Aquino S, Nunes TC, Gonçalez E, Corrêa B, Villavicencio A, editors. Use of electron beam on aflatoxins degradation in coconut agar. Proceedings of the International Nuclear Atlantic Conference, INAC, Rio de Janeiro, Brazil 2009.
18-Ghanem I, Orfi M, Shamma M. Effect of gamma radiation on the inactivation of aflatoxin B₁ in food and feed crops. Brazilian Journal of Microbiology 2008;39(4):787-91.